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拉里·达利（本·斯蒂勒饰）生活似乎不太顺利：经常换工作，居无定所；妻子与他离婚，找了一个证券经纪人，即将再婚，自己在儿子心目中的地位也岌岌可危。达利为了挽救自己的生活，也为了争取到儿子的抚养权，他不得不放弃“做大事”的梦想，成为了纽约自然博物馆的夜间警卫。达利原本以为这是一份无聊的工作，谁知道上班的第一天，不可思议的事情就发生了：博物馆里的法老金牌拥有神奇的魔法，当夜晚来临的时候，馆中所有的标本都会活过来，追逐骨头的霸王龙、爱捣乱的猴子、暴虐的匈奴王、钻木取火的穴居人……将一切弄得不可开交。在26任总统特迪·罗斯福的帮助下，达利好不容易控制住了局面，但是，他马上又遇到了新的麻烦：有人想打法老金牌的主意。职责所在，也是为了博物馆夜晚的奇迹，达利不得不挺身而出。在布鲁克林，拉里·戴利是一位离婚的有抱负的发明家，在工作和公寓之间来回奔波。他的前妻艾丽卡（Erica）同情他的处境，但认为他给他们十岁的儿子尼克（Nick）树立了一个坏榜样。尼克是一名小学生，考虑退出冰球运动，并计划长大后像他母亲的未婚夫唐（Don）一样成为一名债券交易员。 ; 而拉里则担心尼克崇拜唐而不是他，尤其是在尼克决定邀请唐参加他学校的职业日之后。拉里被聘为自然历史博物馆的夜间保安，接替退休的警卫塞西尔·弗雷德里克斯及其同事格斯和雷金纳德。塞西尔给了拉里一本特殊的说明手册，警告他不要“让任何东西进……或出”。在他的第一个晚上，拉里发现博物馆的展品在日落后变得栩栩如生，包括：“Rexy”，一尊顽皮的霸王龙骨架；德克斯特是一只顽皮的卷 尾猴，他毁掉了拉里的手册以及其他动物标本，后来还拿走了他的钥匙；描绘旧西部、古罗马和古玛雅的相互竞争的微型文明；喜欢嚼口香糖的复活节岛摩艾；匈奴王阿提拉、美国内战士兵、纵火狂尼安德特人以及萨卡加维亚的蜡像 ，他被封闭在玻璃中，无法听到外面的任何人或任何声音。骑着马的泰迪·罗斯福将拉里从不和的微型领导人杰迪代亚和奥克泰维斯手中救了出来，并解释说，自从一件古埃及文物——法老阿克曼拉的金碑——于 1952 年抵达以来，展品每天晚上都会变得栩栩如生，但如果离开就会变成灰尘日出时的博物馆外。当泰迪帮助恢复秩序时，拉里得知泰迪爱上了萨卡加维亚，但害羞而不敢和她说话。塞西尔、雷金纳德和格斯检查拉里，拉里决定辞职，但尼克和唐过来祝贺他获得新工作。拉里为了儿子的缘故决定留下来，塞西尔建议阅读历史。拉里（Larry）能够更好地控制展品，但被迫扑灭尼安德特人在自己的展览中引起的火灾，而德克斯特（Dexter）再次偷了拉里（Larry）的钥匙并打开了一扇窗户，让尼安德特人跳出了窗户并逃到了展览中心。街上，看到一群无家可归的人正在使用火坑。沮丧的拉里再次决定退出，但无法拯救逃脱的尼安德特人免于在初升的太阳中解体，而他的遗体则被街道清扫工扫走了。。尼克目睹博物馆馆长麦克菲博士因尼安德特人展览受损而解雇了拉里，但拉里说服他重新考虑。丽贝卡·哈特曼 (Rebecca Hutman) 是一名博物馆导游和历史学家，她正在撰写有关萨卡加维亚的论文，她认为拉里告诉她博物馆的夜间秘密时是在嘲笑她。拉里带尼克来到博物馆，但什么也没发生，他们发现塞西尔、格斯和雷金纳德偷了停用的平板电脑。与展品一样，年长的守卫从平板电脑中获得了增强的活力，并密谋将其与其他有价值的文物一起偷走，并陷害拉里的盗窃行为。尼克重新激活了平板电脑，使博物馆恢复了生机，整个博物馆开始了一场追逐，但当塞西尔抢走平板电脑并将尼克和拉里锁在埃及房间时，追逐停止了。拉里从石棺中释放了阿克门拉的木乃伊，法老帮助拉里和尼克逃脱。他们发现其他展品互相争斗，拉里说服他们联合起来抓住守卫并收回平板电脑。格斯和雷金纳德被抓获，塞西尔乘坐小马快车 驿马车逃脱，泰迪将萨卡加维亚推离塞西尔的道路，被切成两半，但仍然活着。拉里追着塞西尔进入中央公园，阻止了他并夺回了平板电脑，而泰迪在萨卡加维亚修复他时终于与她建立了联系。丽贝卡看到展品返回博物馆并意识到真相，拉里向她介绍了萨卡加维亚。第二天，在新闻报道了当晚发生的奇怪事件后，麦克菲试图解雇拉里——比如尼安德特人在博物馆地铁站留下洞穴壁画，以及中央公园雷克西的恐龙足迹。– 但宣传提高了博物馆的参观人数。拉里被重新聘用，并与尼克、丽贝卡和出席的展览一起举办派对庆祝当晚。在片尾字幕中，塞西尔、格斯和雷金纳德被迫担任博物馆看门人，作为对他们罪行的惩罚，并在派对结束后进行清理工作。
